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Exosome-baseddeliveryofsuper-repressorIκBαrelievessepsis-associatedorgandamageandmortality基于外泌体的超级抑制因子IκBα的递送减轻了败血症相关的器官损伤和死亡率

摘要

作为通过将细胞物质转移到受体细胞而在细胞间通讯中发挥积极作用的细胞外囊泡，外泌体具有作为天然治疗药物递送载体的巨大潜力。各种疾病模型中的炎症反应可以通过引入超级阻遏物IκB(srIκB)来减弱，它是IκBα的主要活性形式，可以抑制核因子κB转位到细胞核中。我们之前开发的光遗传工程外泌体系统(EXPLOR)用于将大量srIκB加载到外泌体中。我们表明，腹膜内注射纯化的srIκB负载外泌体（Exo-srIκBs）可降低脓毒症小鼠模型的死亡率和全身炎症。在生物分布研究中，主要在中性粒细胞中观察到Exo-srIκB，在较小程度上的单核细胞中，在小鼠的脾脏和肝脏中。此外，我们发现Exo-srIκB减轻了单核细胞THP-1细胞和人脐静脉内皮细胞的炎症反应。

背景

脓毒症是由急性微生物感染引起的先天免疫系统激活引起的全身炎症综合征。是重症监护病房死亡的主要原因，据估计，美国和欧洲每年有,至,名患者发生败血症。每年的9月13日，全球脓毒症联盟都会公布“世界脓毒症日”。脓毒症是一种严重的疾病，已成为一个重大的社会问题。此前，Xigris于年推出，是美国食品和药物管理局批准的唯一一种败血症治疗药物；然而，由于出血相关的副作用和缺乏疗效，它于年10月退出市场。目前，尚无脓毒症特异性治疗可供临床使用。迫切需要开发有效的败血症替代疗法。

不受控制的炎症是脓毒症反应的一个突出特征。Toll样受体介导的宿主-病原体相互作用会刺激促炎细胞因子、趋化因子和免疫激活分子的产生。这种促炎反应之后是补偿性免疫抑制反应，涉及免疫细胞的各种数量和功能缺陷。病原体诱导的细胞修饰伴随着宿主基因表达的显着变化，核因子κB(NF-κB)转录因子在调节这些变化中起关键作用。NF-κB调控下的几种细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1(IL-1)，可以诱导这种转录因子的进一步激活，导致炎症反应和脓毒症的增强。此外，NF-κB主要通过增强Bcl-xL、A1和A20等抗凋亡基因的转录参与细胞凋亡反应。因此，与NF-κB激活相关的炎症可以通过两种相互作用机制加剧，促炎介质的表达增加和细胞群（如中性粒细胞）的寿命延长，这些细胞群被激活产生促炎分子并直接参与急性炎症过程.

最近对脂多糖（LPS；内毒素模型）或盲肠结扎和穿刺（CLP；多微生物模型）诱发的脓毒症动物模型的研究表明，具有不同化学性质和作用机制的NF-κB抑制剂可保护动物免受脓毒症致死。尽管已经报道了多种NF-κB抑制剂，迄今为止还没有NF-κB阻滞剂被批准用于人类。已发现各种类固醇和非类固醇抗炎药可阻断NF-κB，但它们的作用具有高度多效性且缺乏特异性。近年来，针对NF-κB激活途径中关键元素的特异性抑制的新型治疗策略正在开发中，人们对其作为败血症治疗的潜在功效寄予厚望。表达无磷酸化位点的核因子κBα(IκBα)蛋白工程抑制剂的基因构建体、超级阻遏物IκB(srIκB)也已被使用。特定磷酸化位点的IκBα突变（Ser32和Ser36替换为Ala)导致IκBα的主要活性形式，具有延长的半衰期。这些srIκB导致稳定的IκBα细胞质池，从而阻止核NF-κB激活。

本实验使用外泌体作为治疗载体将srIκB递送到治疗靶点。外来体被认为是运送载体作用于各种蛋白质和调控基因到靶细胞。它们起到非免疫原性纳米囊泡的作用，可以保护其货物免受血清蛋白酶和免疫反应的影响。将可溶性蛋白质加载到外泌体中是通过一种称为EXPLOR的技术实现的，该技术利用了自然外泌体生物发生过程和由光遗传学控制的可逆蛋白质-蛋白质相互作用。为了将特定的靶蛋白加载到外泌体中，我们生成了一个人胚胎肾(HEK)T细胞系，该细胞系稳定表达两种重组蛋白CIBN-EGFP-CD9和srIκB-mCherry-CRY2。与之前的研究一致，EXPLOR技术被用于生产加载srIκB的外泌体。我们将加载srIκB的外泌体指定为Exo-srIκB，将从完整HEKT细胞产生的外泌体指定为Exo-Na?ve。通过将Exo-srIκB应用于脓毒症模型以达到治疗目的，我们改善了脓毒症诱导的器官损伤并抑制了促炎细胞因子的分泌，从而提高了脓毒症患者的总体生存率。

结果

加载srIκB的外泌体的表征

和分析

为了产生足够的外泌体，我们从每种细胞类型中收集了培养基。使用切向流过滤(TFF)和尺寸排阻色谱(SEC)的组合分离外泌体。为降低SEC柱上载的杂质超过其结合能力的风险，样品经过渗滤并通过TFF浓缩。在TFF之后，将浓缩的培养基加载到SEC柱上进行进一步纯化。然后进行第二次TFF以浓缩外泌体。通过纳米粒子追踪分析(NTA)分析通过顺序纯化分离的每种类型的外泌体，该分析表征外泌体的大小和浓度。直径30~nm的颗粒占所有颗粒的80%以上，平均粒径为nm，这与外泌体的特征尺寸范围（30至nm）一致。此外，透射电子显微镜(TEM)显示完整的杯状膜囊泡，其大小与从Exo-Na?ve和Exo-srIκB获得的NTA结果相对应。为了进一步表征我们制剂中的外泌体，我们通过蛋白质印迹研究了两种常见的外泌体标记物，即四跨膜蛋白CD63和TSG。在样品中观察到CD63和TSG的存在，而高尔基体衍生的污染物GM仅在细胞裂解物中检测。对外泌体制剂的分析表明它们表现出外泌体的特征。此外，我们观察到srIκB-mCherry-CRY2（kDa）稳定加载到从srIκB稳定细胞系中分离的外泌体中。

Fig.1Generationandcharacterizationofengineeredexosomes.(A)SchematicofDNAconstructsusedfortheproductionofExo-srIκB(top).Schematicshowingfusionproteinsandtheirproposedactivities(bottom).(B)MorphologicalcharacterizationofExo-Na?veandExo-srIκBthroughtransmissionelectronmicroscopy.(C)HEKTcellsthatstablyexpressmCherryorsrIκB,andexosomesfromtheseHEKTcells,werelysedandimmunoblottedagainsttheindicatedproteins.IB,immunoblot.

Exo-srIκB提高败血症小鼠的

存活率并改善急性器官损伤

我们研究了腹腔注射Exo-srIκB是否能防止内毒素休克。动物接受单次腹腔注射致死剂量的LPS（C57BL/6为40毫克/公斤体重，BALB/c为20mg/kg体重），然后单次腹膜内注射Exo-srIκB。与LPS诱导的败血症导致%死亡率的对照C57BL/6小鼠相比，Exo-srIκB处理的小鼠对LPS诱导的死亡率具有显着的抵抗力；大多数小鼠从败血症中获救并显示出延长的存活时间。Exo-srIκB介导的效应与对LPS诱导的温度下降的适度保护有关。我们还使用BALB/c小鼠开发了LPS诱导的败血症小鼠模型。Exo-srIκB治疗显着提高了LPS诱导的BALB/c小鼠败血症的存活率。我们接下来使用CLP诱导的脓毒症模型作为腹腔内脓毒症的标准化鼠模型，研究了Exo-srIκB在存活中的作用。这些动物在7天的监测期内存活下来，表明Exo-srIκB提供了针对败血症死亡率的持久保护。为了进一步研究Exo-srIκB治疗是否减轻了败血症引起的炎症，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定血清中关键炎症因子的浓度。我们观察到在具有LPS诱导的败血症的Exo-srIκB治疗组中，促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6以及趋化因子四氯化碳(CCL4)的表达水平显着降低。我们还观察到CLP组的血清TNF-α和CCL4水平显着高于假手术对照组，但在CLP和Exo-srIκB治疗的小鼠中没有升高。这些结果表明，Exo-srIκB可减轻LPS或CLP诱导的炎症，并保护脓毒症小鼠免受急性炎症过程的影响。

大量研究表明，急性肾损伤(AKI)是败血症的一种常见且严重的并发症，发生率为50%或更多，并且与极高的死亡率相关。为了确定Exo-srIκB在脓毒症小鼠模型中CLP诱导的AKI中的作用，进行了肾脏组织学检查。与接受假手术的小鼠相比，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠和Exo-Naive小鼠的肾小管细胞在空泡化、刷状缘丢失和肾小管上皮细胞核凝聚方面表现出明显的损伤细胞。值得注意的是，Exo-srIκB治疗显着减少了对肾小管区域的损伤，保留了近端小管，并证明了Exo-srIκB对脓毒症引起的肾损伤的治疗潜力。这些结果与LPS诱导的AKI的结果一致。我们进一步量化了组织学肾损伤的严重程度，发现Exo-srIκB治疗使两种脓毒症模型的损伤评分显着降低了50%。Exo-srIκB改善了肾小管的退行性变化，尽管存在一些受损区域。这些数据表明Exo-srIκB在改善脓毒症小鼠肾脏生理结构和功能方面的重要性。

Fig.2TheprotectiveeffectsofExo-srIκBinendotoxemiaandCLP-inducedsepsis.

(A)Survivalcurvesofphosphate-bufferedsaline(PBS)–,Exo-Na?ve–,andExo-srIκB–treatedsepticmice.LPSC57BL/6mice(n=5to6pergroup),LPSBALB/cmice(n=10pergroup),andCLPC57BL/6mice(n=14to15pergroup).**P0.01and*P0.05