本栏目由“世界科学”和“赛先生”联合出品

本文围绕年度上海市科技进步奖二等奖项目“DNA量值溯源体系在儿童易感病原微生物准确检测中的应用”展开，该奖项由上海市计量测试技术研究院刘刚教授领衔的团队获得。

伽利略曾说过：“测量一切可测之物，并把不可测的变为可测。”测量是我们观察和研究客观世界的工具，更与我们的生存密切相关！

面对病原细菌，准确和灵敏的检测——细菌检测帮助我们及时构筑公共安全防线。发展全世界等效一致的病原微生物测量能力是当下公共安全的重要任务。那么人们是怎么实现“靠谱”的细菌检测，怎么确保结果准确可靠？

从测量的概念说起

测量是按照某种规律，用数据来描述观察到的现象，即对事物作出量化描述。

科学上对于测量的定义，是指将被测量与具有计量单位的标准量在数值上进行比较，从而确定二者比值的实验认识过程。

自从米制公约为代表的现代计量科学建立以来，传统量的测量都陆续实现了计量溯源，即有准确的计量标准器具可与之相比较，从而关联到7个国际基本单位所代表的“恒定量值”。

所以在计量法和一系列的管理制度支撑下，我们生活中的绝大多数测量过程都是“非常靠谱”的。

但是生命科学世界的分析测试过程就复杂多了，因为生物分析测试过程往往面对复杂的生物样品，多数生物分析偏重定性分析或相对定量，而能够实现可靠的、绝对定量的方法非常缺乏。

细菌检测就是一个典型的例子，科学家努力地进入微观世界，并对认清细菌特征付出了非常大的努力，但是想要准确定量细菌的存在，甚至“刻度”细菌的浓度，这是一个很大的挑战。在我们国家标准物质库中首次出现细菌相关的一级标准物质还是年才发生的事情。

哪些病原细菌需要准确检测

病原微生物感染是人类健康的重要威胁，尤其是抵抗力不成熟并且易于交叉感染的儿童，若患儿未得到及时诊疗，轻则导致营养不良,重则危及生命。严重的暴发流行往往发生在幼儿园、学校，例如年日本“O感染事件”中，有几千名儿童被感染。很多病原细菌已经成为著名的麻烦制造者：

大肠杆菌（Escherichiacoli），又叫大肠埃希氏菌。大肠杆菌是条件致病菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等多种局部组织器官感染。

致病性大肠杆菌分为5类：肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌。其中最具有代表性的就是代号为O：H7的肠出血性大肠杆菌。大肠杆菌

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)也称金葡菌，隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌代表，为一种常见的食源性致病微生物。该菌最适宜生长温度为37℃，pH为7.4，耐高盐，可在盐浓度接近10%的环境中生长。金黄色葡萄球菌常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、痈、化脓疮口中，空气、污水等环境中也无处不在。

阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)是在乳制品中发现的一种致病菌，由于其能污染婴儿配方奶粉而导致婴儿及早产儿脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎，死亡率高，故已引起多国相关部门的重视。

霍乱弧菌（Vibriocholerae）是能引起一类以腹泻为主要症状的烈性传染病的一种致病菌，临床上以剧烈无痛性泻吐、米泔水样大便、严重脱水、肌肉痛性痉挛及周围循环衰竭等为特征，急性霍乱患者如不及时治疗，死亡率高达50%。霍乱弧菌的快速准确鉴定，对该病的预防和治疗有着重要作用。该病曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死亡率甚高，属于国际检疫传染病。

单核细胞增生李斯特氏菌(L.Monocytogenes)简称单增李斯特菌，归属于李斯特菌属(Listeria)，是一种重要的人兽共患和食品卫生病原菌，该菌主要通过肉乳及其制品引起人的感染发病，能引起人和动物脑膜炎败血症及孕妇流产等。

哪些方法可以定量检测病原微生物

面对如此复杂的病原微生物家族，科学家发展了先进的分析方法来应对：

其中一类是定性鉴定方法，目标是解决“是什么细菌”的问题；

还有一类方法是定量方法，目标是解决“有多少细菌”的问题。

细菌定性鉴定方法有很多，如形态学观察、血清分型、生化分析、遗传学分析等。遗传学分析法有基因序列分析、分子标记检测、核酸分子杂交等。

细菌定量测量方法主要有三类：

麦氏比浊法（Mcfarland）

这是一种简单而经典的细菌浓度计算方法，它的核心原理是细菌溶于水中会造成与浓度相关的混浊度。

最早的麦氏比浊检测法采用手动比较法：利用不同比例的硫酸和氯化钡配制5个标准管，这样不同比例生成的硫酸钡沉淀的浊度不同，可以分别代表不同的微生物浓度，通过比较样品与标准管浊度就可以判定细菌浓度。

在微生物检测领域，麦氏比浊法被广泛用于细菌鉴定前的定量；该方法也常用于医药学领域的微生物抗药物敏感性试验中，用来测量最小抑菌浓度；也可以用于微生物发酵领域，适用于微生物发酵浓度的实时监测。

麦氏比浊管

基于传统培养法的菌落计数

将细菌接种于人工创造的培养基，通常是牛肉汤、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、血液等和某些细菌所需的特殊物质配制成液体、半固体、固体，然后提供充分的生长环境（温度、pH值、时间，对氧的需求与否等），在足够的生长时间之后，我们就可以在显微镜下对培养出来的菌落进行分析。

将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。

菌落计数方法需要的时间比较长，通常需要十几个小时，个别细菌如结核菌要培养1个月之久。但是菌落计数的方法直观而稳定，被认为是细菌检测的金标准。

以PCR为代表的核酸分析方法

在遗传学鉴定分析的过程中，人们发现，细菌内部都含有携带遗传信息的特征基因，通过检测基因即可对细菌进行分析。

定量PCR技术的发展给我们提供了强大的工具，它通过运行生物体外的特殊DNA复制，放大扩增特定的DNA片段，这类方法较传统的培养法具有明显优势：

首先，比培养法更快、通量更高；其次，种类特异性基因或者耐药基因的检出具有确证意义和定量意义；第三，最重要的是核酸检测的灵敏度更高。

随着实时荧光定量PCR技术的发展，仪器普及程度逐渐提升，在病原细菌检测领域的应用不断扩展。

怎么建立病原微生物检测的计量标准

既然知道了细菌定量的三类主要方法，那么怎么实现三个量值的计量标准呢？

前两种方法（下图中的1和2）定量测量的物理原理明确，溯源链条比较清楚，中国计量科学研究院和广东省计量科学研究院通过技术攻关先后建立了细菌浊度和模拟菌落的标准物质，很快相对应的仪器计量校准规范也建立起来。这样一来，所有通过麦氏比浊检测细菌的结果，可以通过与标准物质的麦氏单位进行比较，而菌落计数方法可以通过与标准物质的菌落个数进行比较，从而找到细菌检测的“刻度”。细菌检测计量溯源链条

细菌核酸检测方法的计量溯源就更加复杂，在进入21世纪第一个十年，核酸浓度量值计量标准还是空白呢，当时找不到DNA的浓度量值可以比较的标准物质。解决这个问题有两个技术途径：

一是通过元素分析，让DNA浓度变得可比较。

基于核酸分子特殊的分子组成，利用磷（P）元素与DNA拷贝数的固定关系，定量DNA分子数的机制，利用高分辨电感耦合等离子体质谱（HR-ICP-MS）超高的分辨率和准确度，开展低浓度核酸样品的定量分析，将核酸分子浓度溯源至国际单位制。当然这个过程其实并不简单，需要我们克服：磷元素响应差导致检测结果不稳定的技术难题；需要经过样品多步纯化，去除环境中无极磷的影响；需要与其他核酸定量方法比对，实现高度一致性。

二是利用数字PCR(dPCR)让DNA分子变得“可数”。

数字PCR核酸检测是基于高通量样品分配，单分子扩增，以及基于泊松分布公式统计原理，无需标准曲线，直接实现核酸拷贝数定量，逐渐被国际计量领域认可为一种基因绝对定量的方法。

我们通过方法优化不断提高扩增效率，消除由于单拷贝扩增失败导致的假阴性dPCR结果，并且通过多种不同原理的dPCR平台进行比对，建立了一套多方法多平台联合定量的核酸测量方案。最终结合了多种不同原理的检测方法，将元素分析与dPCR联合定量，开展了核酸标准物质的研制工作，针对阪崎肠杆菌、致病性弧菌、病毒性腹泻病原体、手足口病相关肠道病毒、肠道致病菌等病原微生物，研制了超过30种核酸检测标准物质。这样终于完成了细菌通过DNA浓度实现计量溯源的比较链条，把细菌检测结果关联到摩尔单位。该研究获得了年度上海市科技进步奖二等奖。

检验结果等效一致是全世界的共同愿望

随着病原细菌定量检测的计量溯源体系的建设，中国整体的细菌定量结果的可靠性和准确度都有了计量保障。

一方面，支撑核酸定量分析相关的仪器计量校准能力建设，其中涵盖PCR仪、实时荧光定量PCR仪、微量核酸蛋白定量仪、电泳分析仪等，为大量的生物分析实验室的仪器准确测量提供保障；

另一方面，通过有证标准物质的发放，为检测实验室提供了量传依据，推动实验室内部质控，能力考察工作的开展，与检测实验室形成联动机制，通过组织核酸样品联合定制，驱动细菌检测整体能力水平的提高。

总体来说，细菌检测只是生物分析计量溯源的一个有代表性的领域，但是完整的生物计量技术的建设还有很多问题需要解决。但不管如何，实现生物量测量的国际等效一致是全世界人民共同的愿望。随着国力的发展，我们建设中国的质量技术基础的决心更加坚定，必将通过持续不断的发展生物量的计量标准，建设靠谱的生物量测量体系，推动人民健康事业、生物医药产业的高质量发展。

这个项目的成果探索性地建立了几种病原微生物核酸计量溯源方法，后来，这个原始创新工作很快被证明具有很好的普适性和预见性。

年初，课题组基于本项目的核心技术迅速研发了新冠病毒核酸标准物质，在多家机构广泛应用，为科研机构、检验实验室和试剂盒企业等提供计量溯源和质量控制支撑，为疫情防控贡献了科技力量。-本文作者刘刚是上海市计量测试技术研究院教授-

“世界科学”联合“赛先生”