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腺相关病毒(AAV)是将CRISPR-Cas9递送至人体实现编辑基因治疗疾病的有力工具。作为基因治疗的明星载体，AAV以其较高的组织特异性、安全性以及长时间表达等优势，目前已经被广泛地应用于体内目的基因编辑。但AAV在基因治疗领域仍然面临着许多挑战，包括转导效率低、免疫原性高、基因递送容量有限、生产成本高等。

加州大学旧金山分校的助理教授NicolePaulk堪称是病毒基因治疗领域的先驱。她在UCSF的实验室为AAV设计颠覆性的技术。对于Paulk而言，为患者提供安全有效的基因疗法是其实验室发展的动力。本文将介绍Paulk在CRISPRMedicineNews中发表的对AAV应用挑战与前景的看法。

低剂量AAV的应用或将实现

高剂量AAV基因治疗所带来的问题之一是无论靶向的组织或器官是什么，大多数全身给药的AAV最终都会进入肝脏。因此，预先存在肝脏炎症或疾病的患者发生不良事件的风险就可能更高。

年，基因疗法公司Audentes启动用于治疗X连锁肌管肌病（XLMTM）的ASPIRO试验，由于试验中的3名患者预先存在肝胆疾病，导致他们在接受治疗后因细菌感染和败血症而死亡。

尽管许多研究人员和临床医生一直在强调如何安全管理使用高剂量AAV，但Paulk坚持认为科学界应该将目光放在如何设计AAV，使其不再需要通过高剂量发挥作用。Paulk表示，设计的方向之一是提高AAV的效力。目前有几种方法可以提高AAV的效力和稳定性，大多数方法都集中在优化AAV的制造和纯化过程以及改进储存载体的试剂方面。此外，许多团体正在研究新的给药方法，以避免接触肝脏和免疫系统。

设计衣壳使其进入“隐身模式”

机体的免疫反应是基因治疗的主要障碍。目前主要通过使用皮质类固醇治疗患者以暂时减弱免疫系统攻击AAV来解决这个问题。AAV研究的一个关键是设计衣壳（包裹病毒的蛋白质外壳），使其能够更有效地到达目标细胞而不受免疫干扰。

Paulk表示，关于衣壳设计有许多工作要做。比如开发新的更具特异性的衣壳血清型，又或者开发与已有血清型相比更具免疫逃避性的新血清型。如果我们可以将衣壳设计成免疫逃避性，它们就不太可能被免疫细胞或血液中预先存在的中和抗体束缚住。从某种意义上说，它们能实现“隐身”，并且更有可能真正到达目标组织。

解决这个问题的另一种方法是将AAV包裹在一种物质中，这种物质将直接保护它免受免疫反应的影响。一些研究团队正在尝试将AAV包裹在其他材料中——例如纳米颗粒、细胞、病毒样颗粒(VLP)、脂质载体和外泌体等。

AAV1的3D模型

利用细菌酶创造安全的时间窗口

许多患者无法参与AAV基因治疗的临床试验，因为此前接触过野生型病毒，其血液中已经存在针对AAV衣壳的中和抗体。这些抗体通过在AAV到达目标组织之前使其失活而使治疗无效。

解决这个问题的方法之一是重新利用最初在细菌中发现的酶，以消除血液中预先存在的抗AAV中和抗体，这也是Paulk感兴趣的研究领域。在基因治疗前给药工程化IdeS（来自化脓性链球菌的免疫球蛋白降解酶）和IdeZ（来自马链球菌动物流行病亚种的免疫球蛋白降解酶），可导致抗AAVIgG抗体的短期去除，使AAV有足够时间到达目标细胞。

Paulk表示，在此期间血液中没有IgG抗体循环，即使患者以前接触过野生型AAV，也可使用AAV作为递送载体。这让原本被排除在试验之外的患者也能受到治疗，从而扩大患者范围。对于没有替代疗法的罕见疾病患者而言，这些酶为重新给药创造一个安全的时间窗口。

来自链球菌等细菌的酶可以消除抗AAV中和抗体

研究和提高AAV的编辑效率

低编辑效率，尤其是体内的低编辑效率，也是研究人员面临的挑战之一。Paulk表示AAV基因编辑通常在肝脏中进行，因为它是最容易靶向的目标。研究和提高AAV的编辑效率是Paulk和大量全球研究人员目前正在开展的工作。与此同时，一个更有效的方法是开发新的基因编辑疗法来治疗不需要高编辑效率的疾病。

设计稳定的末端重复序列ITR

AAV具有单链线性DNA基因组，单链基因组的末端被称为反向末端重复序列(ITR)的小结构“加盖”。ITR在病毒DNA的末端相互循环的地方形成，形成基因组中唯一的双链区域。当用于基因治疗时，ITR会被宿主细胞核中的酶结合以延伸、转录和翻译病毒DNA。这个过程看起来很简单，然而，正如Paulk所说，这存在许多可变性。

ITR非常不稳定，至少在基因疗法中使用的重组AAV的情况是这样。ITR可以相互重组，也可以在内部重新排列，因此宿主酶很难找到它们的结合识别序列，并将基因组从单链扩展到双链。它们也可以产生突变，使关键结合位点完全丢失。在这种情况下，它们将具有高度的致突变性。

我们需要想出新的方法来制作保持相同ITR序列的AAV，使其在生产过程中更加稳定，或者保持相同的生产方法但设计新的不太可能重组和变异的稳定的ITR。有许多学术团体正在研究这个问题。

AAV和AAV载体的基因组结构

逆势而上，跳出思维定式

AAV研究有许多前进的方向，而对于Paulk来说，最好的前进方式是逆势而上，从头开始，跳出思维定式。

Paulk表示，那些更宏大、更疯狂的想法，那些可能会带来千倍改进的想法，会打破既定的规则。与其采用我们迄今为止所做的单克隆抗体技术，不如设计一些完全不同的东西。假设你是一名不知道什么是病毒的工程师，有人来找你说他们想要一个带有DNA的二十面体蛋白质，你会怎么做？我们需要想出全新的AAV制造方法，这些方法专为AAV设计并针对AAV进行优化，而不仅仅是适应现有技术。

这些冒险的做法将更具挑战性，并有可能彻底改变AAV基因治疗领域。现在是我们开始大冒险的时候了。

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